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五 单克隆抗体制备技术服务

本项技术服务主要包括:
    - Balb/c纯系小鼠免疫;
    - 脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合;
    - 抗体产生细胞的ELISA筛选;
    - 抗体产生细胞的亚克隆与扩增;
    - 指定细胞克隆的体外培养或腹水瘤接种法生产单克隆抗体。

1、抗原表位设计
    使用特有分析软件,以在线分析方法为辅助,综合蛋白三维结构、活性位点、亲水性等因素,多参数预测抗原表位,大大提高了抗原表位的可靠性,为后续的抗体制备提供了有力保证。

    2、多肽合成
    包括:标准肽合成、肽修饰、不同纯度多肽处理、抗原多肽及其与蛋白的交联等。

    3、重组蛋白抗原制备
    1)重组质粒构建
    2)质粒转化
    3)诱导表达
    4)蛋白纯化
    5)蛋白鉴定
    所得到的重组蛋白,具有较高的纯度和活性,可用于免疫动物以获得单克隆抗体。

    4、杂交瘤制备
    1)免疫动物:免疫动物的选择根据骨髓瘤细胞株的来源而定,常用的骨髓瘤细胞均来自Balb/c小鼠。免疫原可为:可溶性抗原、颗粒性(细胞)抗原。
    2)骨髓瘤细胞的培养。
    3)饲养细胞的制备。
    4)细胞融合。
    5)HAT筛选。
   
    5、筛选分泌抗体的杂交瘤细胞
    一般常用的有:免疫荧光、放射免疫(RIA)、组织化学法和酶联免疫分析(ELISA)法等,以ELISA方法最为常用。

    6、杂交瘤细胞的克隆化培养
    经检测的杂交细胞虽然分泌抗体,但它可能是一个杂交细胞,也可能是多个杂交细胞的后代所分泌的抗体,因此必须进行克隆化培养,以获得得一个既有克隆原性又分泌抗体的杂交瘤细胞株。

    7、单克隆抗体的大量制备
    杂交瘤细胞建成之后,需要制备大量抗体以备使用。把杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔内,在杂交瘤生长的同时渗出大量腹水,腹水含有抗体,每毫升可达到毫克水平,是目前广泛采用的方法。

    8、抗体纯化
    通常讲单克隆抗体已经是很纯的,在实验研究中可以使用,但由于它的来源不同,可能会含有培养基。

    9、抗体鉴定
    杂交瘤细胞建株后,还需对其所分泌的单克隆抗体的理化性质及对抗原的特异性等进行鉴定,通常需进行以下工作:抗原本身的IgG亚类测定;所抗抗原分子量的测定;Western blot鉴定;ELISA效价鉴定等。

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